Lịch học môn Thực tập Sinh - lớp 17YS

Thứ năm - 28/05/2020 15:18
THỰC TẬP SINH - Mã môn học: MSC10309
CHUYÊN NGÀNH VẬT LIỆU Y SINH
KHOA KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VẬT LIỆU
Tháng 6/2020 (Danh sách nhóm thực tập ở dưới cuối thông báo này)

Số buổi thực tập: 08 buổi (sáng từ 8h00 đến 11h00, chiều từ 13h00 đến 16h00)
- Nơi thực tập: PTN. Động vật (Lầu 2, dãy D, cơ sở Nguyễn Văn Cừ)
- Tổng số sinh viên: 43 sinh viên, 2-3 sinh viên/nhóm, 15 nhóm
- Thời gian thực tập: 03, 04, 10, 11/6/2020 (thứ tư, thứ năm)
- Cán bộ giảng dạy:
+ Trưởng thực tập/Giảng viên: ThS. Lê Mai Hương Xuân (PTN. Công nghệ Sinh học phân tử)
+ Chuẩn bị thực tập/Trợ giảng:
ThS. Lê Trung Nghĩa (BM. CNSH Phân tử và Môi trường, Khoa Sinh học - CNSH)
CN. Lê Khả Hân (BM. CNSH Phân tử và Môi trường, Khoa Sinh học - CNSH)

 
* Lưu ý:
- Trước khi đến lớp, đọc tài liệu và tìm hiểu nguyên tắc phương pháp, ý nghĩa của từng bước thí nghiệm, vai trò và độ độc hại của các hóa chất
- Đến lớp đúng thời gian quy định
- Tham gia đầy đủ các buổi thực tập
- Mặc áo blouse khi thực tập
* Đánh giá môn học:
- Trình bày kết quả và biện luận
(đánh giá theo nhóm):
40%

- Thi cuối khóa
(đánh giá cá nhân): 60%


 
Buổi Nội dung thực tập Chi tiết
1 và 2
Ngày 03/6/2020
Sáng

















Chiều
Bài số 1: Tách chiết DNA
  1. Giảng cơ sở của phương pháp tách chiết DNA, bao gồm DNA tổng số và DNA plasmid
 
  1. Sinh viên thực hành tách DNA tổng số, DNA plasmid của Escherichia coli.












Tiếp tục tách chiết DNA tổng số và DNA plasmid

 
1. Tách chiết DNA tổng số
  1. Nhận 01 ống 5 ml môi trường LB nuôi cấy tế bào E. coli
  2. Chuyển 1,5 ml dịch vi khuẩn vào eppendorf (epp). Li tâm thu sinh khối ở 10000 vòng/phút, 5 phút ở nhiệt độ phòng.
  3. Bỏ dịch bên trên. Thu tủa sinh khối tế bào.
  4. Lặp lại từ bước 2 và bước 3 cho đến khi thu hết dịch vi khuẩn trong ống nghiệm
  5. Cho vào epp chứa sinh khối 230 μl dung dịch ly giải (Triton X100 2%, SDS 1%, NaCl 0,1 M, EDTA 1 mM pH 8.0, Tris-HCl 10 mM pH 8.0. Bổ sung thêm 0,04 g hạt glass beads, 200 μl hỗn hợp phenol: chloroform (1:1)). Vortex kĩ trong 3 phút. Sau đó, ly tâm 13000 vòng/phút, 3 phút, thu dịch nổi vào epp mới.
  6. Bổ sung 5 µl RNAse (nồng độ 1 mg/ml). Ủ 37ºC trong 1 giờ.
  7. Bổ sung 250 ul chloroform, đảo đều, li tâm 13000 vòng/phút, 10 phút, nhiệt độ phòng. Thu dịch nổi vào epp mới. Ước tính thể tích thu được.
  8. Thêm vào epp trên 2,5V ethanol tuyệt đối lạnh, ủ ở -20oC, 30 phút.
  9. Li tâm 13000 vòng/phút, 20 phút, 4oC. Hút bỏ dịch nổi, thu tủa.
  10. Rửa tủa trên với 500 ul ethanol 70% lạnh, li tâm 13000 vòng/phút, 10 phút, 4oC. Hút bỏ dịch nổi, thu tủa. Phơi khô.
  11. Hòa tủa vào 20 ul H2O. Giữ ở -20oC.
 
  1. Tách chiết DNA plasmid bằng phương pháp SDS – kiềm
  1. Nhận 01 ống 5 ml môi trường LB nuôi cấy tế bào E. coli
  2. Chuyển 1,5 ml dịch vi khuẩn vào eppendorf (epp). Li tâm thu sinh khối ở 10000 vòng/phút, 5 phút ở nhiệt độ phòng.
  3. Bỏ dịch bên trên. Thu tủa sinh khối tế bào.
  4. Lặp lại từ bước 2 và bước 3 cho đến khi thu hết dịch vi khuẩn trong ống nghiệm.
  5. Cho vào epp chứa sinh khối 100 ul dung dịch I, vortex đến khi sinh khối huyền phù đều.
  6. Thêm 200 ul dung dịch II, đảo nhẹ epp 6-8 lần. Sau đó thêm tiếp 150 ul dung dịch III, đảo 6-8 lần.
  7. Li tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút, nhiệt độ phòng. Thu dịch nổi vào một epp mới.
  8. Bổ sung 5 µl RNAse (nồng độ 1 mg/ml). Ủ 37ºC trong 1 giờ.
  9. Cho vào mỗi epp 600 µl hỗn hợp phenol : chloroform (tỉ lệ 1:1), đảo 6-8 lần, li tâm 13000 vòng/phút, 5 phút, nhiệt độ phòng. Thu dịch nổi vào epp khác.
  10. Bổ sung 250 ul chloroform, đảo đều, li tâm 13000 vòng/phút, 10 phút, nhiệt độ phòng. Thu dịch nổi vào epp mới. Ước tính thể tích thu được.
  11. Thêm vào epp trên 2,5V ethanol tuyệt đối lạnh, ủ ở -20oC, 30 phút.
  12. Li tâm 13000 vòng/phút, 20 phút, 4oC. Hút bỏ dịch nổi, thu tủa.
  13. Rửa tủa trên với 500 ul ethanol 70% lạnh, li tâm 13000 vòng/phút, 10 phút, 4oC. Hút bỏ dịch nổi, thu tủa. Phơi khô.
  14. Hòa tủa vào 20 ul H2O. Giữ ở -20oC.

01 tiểu nhóm nhận 02 ống nghiệm dung dịch nuôi cấy E. coli
03 tiểu nhóm nhận: Một bộ dung dịch, hóa chất tách chiết
 
       
 

Buổi
Nội dung thực tập Chi tiết
3 và 4
Ngày 04/6/2020
Sáng






















Chiều
Bài số 2: Phân tích DNA
Giảng bài: phân tích DNA bằng phương pháp đo mật độ quang, điện di gel agarose

Bài số 3: Kỹ thuật PCR
  1. Giảng bài Lý thuyết kỹ thuật PCR
  2. Sinh viên thực hành đặt phản ứng PCR. 









Sinh viên thực hành điện di DNA trên gel agarose
  1. Phân tích DNA bộ gene bằng phương pháp đo mật độ quang
Mỗi nhóm pha loãng 5 lần dung dịch DNA thu được ở bài 1. CBGD sẽ đo mật độ quang. Sau đó, mỗi nhóm nhận và phân tích kết quả đo mật độ quang.
  1. Thực hiện nhân bản gene mục tiêu bằng phương pháp PCR
Mỗi tiểu nhóm tiến hành hút lần lượt các thành phần phản ứng PCR vào epp 0,2 ml sao cho đạt nồng độ sau:
DNA tổng số                                 100 ng
hoặc DNA plasmid (từ bài 1)
Buffer (10X)                                 1X
dNTP Mix, 2 mM each                 0,2 mM
MgCl2 (25 mM)                            2 mM     
Mồi xuôi (2,5 mM)                       0,2 mM
Mồi ngược (2,5 mM)                    0,2 mM
Taq polymerase (1 u/μl)               0,5 u
Bổ sung dH2O đến                        25 ul  
Đặt epp có chứa hỗn hợp phản ứng PCR vào máy PCR.
03 tiểu nhóm nhận 01 bộ hóa chất cho phản ứng PCR
CBGD sẽ bổ sung enzyme cho các nhóm.
  1. Phân tích DNA bằng điện di trên gel agarose: Mỗi nhóm tiến hành điện di mẫu DNA bộ gene thu được ở bài 1 và sản phẩm PCR thu được ở bài 3
       
 

Buổi
Nội dung thực tập Chi tiết
5 và 6

Ngày 10/6/2020
Sáng


























Chiều
Bài số 4: Biểu hiện protein tái tổ hợp
Giảng về lý thuyết biểu hiện protein tái tổ hợp



Bài số 5: Phương pháp thu nhận protein
Giới thiệu một số phương pháp thu nhận protein







Bài số 6: Phân tích protein
  1. Giảng bài: Phân tích protein bằng điện di SDS-PAGE
  2. Thực hành điện di SDS-PAGE
1. Thực hiện thu nhận riêng các phân đoạn protein tổng, tan, tủa từ dịch phá tế bào E. coli:
- Mỗi nhóm nhận 500 ul dịch phá tế bào E. coli đã được cảm ứng biểu hiện protein mục tiêu (1)
- Hút 50 ul dịch (1) sang 1 epp khác để sử dụng cho bài sau.
- Ly tâm phần còn lại của dịch (1) với tốc độ 13000 vòng/phút trong 3 phút.
- Hút phần dịch nổi sang 1 epp khác (2)
- Hòa tan phần tủa bằng 450 ul H2O (3)
  1. Tinh chế dịch lên men Pichia pastoris bằng phương pháp sắc ký trao đổi ion
  • Mỗi nhóm nhận 2 mL dịch lên men P. pastoris đã được cảm ứng biểu hiện protein mục tiêu (4)
  • Hút 50 ul dịch (4) sang 1 epp khác để sử dụng cho bài sau.
  • Chuẩn bị cột tinh chế cation (rửa cột, cân bằng cột với dung dịch A)
  • Nạp toàn bộ phần còn lại của dịch (4) vào cột. Thu dịch qua cột (5)
  • Rửa cột bằng 5 mL dung dịch A.
  • Thực hiện dung ly thu nhận dịch tinh chế (6) bằng 1 mL dung dịch B.
  1. Thực hiện điện di SDS-PAGE
Đối với các mẫu (1), (2), (3): 04 nhóm thực hiện điện di trên 1 miếng gel à Điện di đợt 1. Sau khi điện di, nhuộm coomassie brilliant blue.
Đối với các mẫu (4), (5), (6): 04 nhóm thực hiện điện di trên 1 miếng gel à Điện di đợt 2. Sau khi điện di, nhuộm AgNO3.

Quy trình điện di SDS-PAGE:
  • Hút 50 µl mẫu protein vào epp mới. Bổ sung 10 µl dung dịch xử lý mẫu 6X. Trộn đều. Đun ở 100ºC trong 15 phút. Ngâm nước đá trong 5 phút.
  • Nạp 10 µl mẫu đã xử lý vào giếng.
  • Điện di với dòng điện có cường độ ổn định 2 mA/giếng, hiệu điện thế 110 V trong 30 phút, sau đó, chỉnh hiệu điện thế 220 V đến khi vạch xanh ra khỏi gel.
  • Lấy gel ra khỏi hệ thống. Tiến hành nhuộm gel.
Quy trình nhuộm gel bằng coomassie brilliant blue:
  • Chuyển gel vào hộp thuốc nhuộm coomassie brilliant blue. Lắc nhẹ trong 30 phút.
  • Chuyển gel vào hộp chứa dung dịch giải nhuộm. Lắc nhẹ đến khi nền gel hết màu xanh.
Quy trình nhuộm gel bằng AgNO3:
  • Ngâm gel trong dung dịch cố định 1. Lắc nhẹ trong 20 phút.
  • Ngâm gel trong dung dịch cố định 2. Lắc nhẹ trong 10 phút.
  • Rửa bằng nước 3 lần, mỗi lần rửa 1 phút.
  • Ngâm gel trong dung dịch Na2S2O3 0.02% và lắc nhẹ trong 90 giây. rửa miếng gel 3 lần bằng nước cất, mỗi lần rửa 1 phút.
  • Ngâm gel trong dung dịch AgNO3 0.2% và ủ 30 phút trong tối ở 4oC.
  • Chuyển gel sang dung dịch hiện bạc, lắc nhẹ cho tới khi gel hiện rõ các vạch thì bổ sung dung dịch dừng phản ứng.

CBGD chuẩn bị gel SDS-PAGE và gỡ gel sau khi điện di xong.
       
 

Buổi
Nội dung thực tập Chi tiết
7 và 8

Ngày 11/6/2020
Sáng
























Chiều
Bài 6: Phân tích protein (tiếp theo)
  1. Giảng bài: Một số phương pháp định lượng protein
  2. Thực hành xác định nồng độ protein bằng phương pháp Bradford
  3. Thực hành xác định tỷ lệ % protein mục tiêu






Tiếp tục thực hành các kỹ thuật phân tích protein
  1. Xác định nồng độ protein tổng bằng phương pháp Bradford
  • Mỗi nhóm đo nồng độ các mẫu có chứa protein ở trên.
  • Hút 300 µl mẫu vào ống nghiệm. Bổ sung 1200 µl thuốc thử Bradford. Trộn đều. Để yên 10 phút.
  • Đo mật độ quang ở bước sóng 595 nm.
  • Dựa trên đường chuẩn và giá trị OD595 đo được, tính toán nồng độ protein trong mẫu. Kết quả được chấp nhận khi giá trị OD595 nằm trong giới hạn tuyến tính của đường chuẩn.
 
  1. Xác định tỷ lệ % protein mục tiêu bằng phần mềm GelAnalyzer
  • Gel điện di SDS-PAGE được scan để lưu trữ dưới dạng file ảnh.
  • Mở phần mềm, chọn New analysis, chọn file ảnh muốn phân tích.
  • Chọn Add new lane tại mục Lanes mode để chọn giếng điện di cần phân tích. Có thể sử dụng chức năng Modify lanes để chỉnh sửa lại khu vực chọn.
  • Chuyển qua thẻ Bands mode, chọn Add new band để bắt đầu xác định từng vạch protein. Sau khi đã chọn đủ các vạch protein có trong giếng, chuyển qua bước tiếp theo.
  • Vào thẻ Background subtract mode, chọn Rolling ball. Lúc này một bảng nhỏ hiện ra, nhập giá trị cho Ball radius.
  • Sau khi thực hiện bước Rolling ball, ô Analysis info sẽ hiện ra thông tin về diện tích của các vạch trên giếng. Tỷ lệ của protein mục tiêu trong hỗn hợp là tỷ lệ diện tích của protein mục tiêu trên tổng diện tích.
CBGD scan gel điện di của các nhóm
03 tiểu nhóm chuẩn bị 01 laptop
    
DANH SÁCH CHIA NHÓM
THỰC TẬP SINH - NĂM 2020
STT Nhóm MSSV HoTen
1 1 1719026 NGUYỄN CHÍ CƯỜNG
2 1719146 ĐOÀN TẤN PHÁT
3 1719159 TRẦN ĐĂNG QUANG
4 2 1719020 TRƯƠNG QUỐC ANH
5 1719153 LÂM GIA PHÚC
6 1719072 THƯỢNG THÁI HIẾU
7 3 1719256 ĐẶNG THỊ NGỌC Ý
8 1719125 VŨ NGUYỄN KIM NGỌC
9 1719165 NGUYỄN NGỌC SƠN
10 4 1719041 PHẠM NGỌC DŨNG
11 1719110 TRƯƠNG CHÍ LỰC
12 1719207 NGUYỄN BÁ TÒNG
13 5 1719064 TRẦN NGUYỄN ANH HÀO
14 1719135 ĐỖ THỊ HỒNG NHI
15 1719102 PHẠM NGÔ THÙY LINH
16 6 1719188 LÊ NGỌC THỊNH
17 1719068 NGUYỄN THỊ THU HIỀN
18 1719078 TRẦN HẢI HƯNG
19 7 1719225 NGUYỄN ANH TÚ
20 1719040 ĐÀO PHÚC ĐỨC
21 1719087 TRẦN THỊ THU HUYỀN
22 8 1719164 LÊ VĂN SĨ
23 1719141 NGUYỄN THỊ HỒNG NHUNG
24 1719202 LÊ THỊ MỸ TIÊN
25 9 1719232 DƯƠNG KIM TUYẾN
26 1719169 LÊ HOÀNG MINH TÂN
27 1719195 PHAN KIỀU THƯ
28 10 1719107 NGUYỄN HỮU LUÂN
29 1719033 MAI CÔNG DANH
30 1719212 MAI QUẾ TRÂN
31 11 1719237 HUỲNH THỊ BÍCH TUYỀN
32 1719128 PHẠM NGỌC NGUYÊN
33 1719094 DƯƠNG LÊ VĨNH KỲ
34 12 1719088 NGUYỄN QUANG KHẢI
35 1719092 TRẦN TRUNG KIÊN
36 1719122 VŨ ĐÌNH NAM
37 13 1719133 TRẦN VĂN NHÂN
38 1719227 HUỲNH ANH TUẤN
39 1619064 VÕ DUY  HIỂN
40 14 1719054 DƯ MỸ HÂN
41 1719222 HÀ NGỌC TRƯỜNG
42 15 1719160 NGUYỄN SINH QUÝ
43 1719179 VŨ NGỌC THIÊN THANH

 

Tổng số điểm của bài viết là: 5 trong 1 đánh giá

Xếp hạng: 5 - 1 phiếu bầu
Click để đánh giá bài viết
Bạn đã không sử dụng Site, Bấm vào đây để duy trì trạng thái đăng nhập. Thời gian chờ: 60 giây