Khoa Khoa học và Công nghệ Vật liệu

http://www.mst.hcmus.edu.vn


Lịch thực tập Sinh chuyên ngành Y sinh -K16YS

THỰC TẬP SINH - Mã môn học: MSC10309
CHUYÊN NGÀNH VẬT LIỆU Y SINH
KHOA KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VẬT LIỆU
Tháng 4/2019
 
Số buổi thực tập: 08 buổi (sáng từ 7h30 đến 11h00, chiều từ 12h30 đến 16h00) và 01 buổi ôn tập, báo cáo kết quả
  • Nơi thực tập: PTN. Công nghệ gene và Vi sinh (Phòng A302, cơ sở Thủ Đức – Dĩ An)
  • Tổng số sinh viên: 18 sinh viên, 2 sinh viên/nhóm, 9 nhóm
  • Thời gian thực tập: 03, 04, 10, 11/04 (thứ tư, thứ năm) - Cán bộ giảng dạy:
+ Trưởng thực tập/Giảng viên: ThS. Lê Mai Hương Xuân (PTN. Công nghệ Sinh học phân tử) + Chuẩn bị thực tập/Trợ giảng:
CN. Lê Trung Nghĩa (BM. CNSH Phân tử và Môi trường, Khoa Sinh học - CNSH)
CN. Lê Khả Hân (BM. CNSH Phân tử và Môi trường, Khoa Sinh học - CNSH)
 
 * Đánh giá môn học:
- Trình bày kết quả và biện luận (đánh giá theo nhóm): 30%
- Kiến thức về môn học (đánh giá cá nhân): 50%

- Thi thực hành (đánh giá cá nhân): 20%

* Lưu ý:                                                                         
  • Trước khi đến lớp, đọc tài liệu và tìm hiểu nguyên tắc phương pháp, ý nghĩa của từng bước thí nghiệm, vai trò và độ độc hại của các hóa chất  
  • Đến lớp đúng thời gian quy định           
  • Tham gia đầy đủ các buổi thực tập        
  • Mặc áo blouse khi thực tập          
 
Buổi Nội dung thực tập Chi tiết
1 và 2
Ngày
03/4/2019
Sáng
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 




Chiều
Bài số 1: Tách chiết DNA
  1. Giảng cơ sở của phương pháp tách chiết DNA, bao gồm DNA tổng số và DNA
plasmid
 
  1. Sinh viên thực hành tách DNA tổng số, DNA plasmid của Escherichia coli
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 


Tiếp tục tách chiết DNA tổng số và DNA plasmid
 
 
1. Tách chiết DNA tổng số
  1. Nhận 01 ống 5 ml môi trường LB nuôi cấy tế bào E. coli  
  2. Chuyển 1,5 ml dịch vi khuẩn vào eppendorf (epp). Li tâm thu sinh khối ở 10000 vòng/phút, 5 phút ở nhiệt độ phòng. 
  3. Bỏ dịch bên trên. Thu tủa sinh khối tế bào. 
  4. Lặp lại từ bước 2 và bước 3 cho đến khi thu hết dịch vi khuẩn trong ống nghiệm 
  5. Cho vào epp chứa sinh khối 230 μl dung dịch ly giải (Triton X100 2%, SDS 1%, NaCl 0,1 M, EDTA 1 mM pH 8.0, Tris-HCl 10 mM pH 8.0. Bổ sung thêm 0,04 g hạt glass beads, 200 μl hỗn hợp phenol: chloroform (1:1)). Vortex kĩ trong 3 phút. Sau đó, ly tâm 13000 vòng/phút, 3 phút, thu dịch nổi vào epp mới.
  6. Bổ sung 5 µl RNAse (nồng độ 1 mg/ml). Ủ 37ºC trong 1 giờ.
  7. Bổ sung 250 ul chloroform, đảo đều, li tâm 13000 vòng/phút, 10 phút, nhiệt độ phòng. Thu dịch nổi vào epp mới. Ước tính thể tích thu được.
  8. Thêm vào epp trên 2,5V ethanol tuyệt đối lạnh, ủ ở -20oC, 30 phút.
  9. Li tâm 13000 vòng/phút, 20 phút, 4oC. Hút bỏ dịch nổi, thu tủa.
  10. Rửa tủa trên với 500 ul ethanol 70% lạnh, li tâm 13000 vòng/phút, 10 phút, 4oC. Hút bỏ dịch nổi, thu tủa. Phơi khô.
  11. Hòa tủa vào 20 ul H2O. Giữ ở -20oC.
 
2. Tách chiết DNA plasmid bằng phương pháp SDS – kiềm
  1. Nhận 01 ống 5 ml môi trường LB nuôi cấy tế bào E. coli  
  2. Chuyển 1,5 ml dịch vi khuẩn vào eppendorf (epp). Li tâm thu sinh khối ở 10000 vòng/phút, 5 phút ở nhiệt độ phòng. 
  3. Bỏ dịch bên trên. Thu tủa sinh khối tế bào. 
     
  1. Lặp lại từ bước 2 và bước 3 cho đến khi thu hết dịch vi khuẩn trong ống nghiệm.
  2. Cho vào epp chứa sinh khối 100 ul dung dịch I, vortex đến khi sinh khối huyền phù đều.
  3. Thêm 200 ul dung dịch II, đảo nhẹ epp 6-8 lần. Sau đó thêm tiếp 150 ul dung dịch III, đảo 6-8 lần. 
  4. Li tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút, nhiệt độ phòng. Thu dịch nổi vào một epp mới.
  5. Bổ sung 5 µl RNAse (nồng độ 1 mg/ml). Ủ 37ºC trong 1 giờ.
  6. Cho vào mỗi epp 600 µl hỗn hợp phenol : chloroform (tỉ lệ 1:1), đảo 6-8 lần, li tâm 13000 vòng/phút, 5 phút, nhiệt độ phòng. Thu dịch nổi vào epp khác.
  7. Bổ sung 250 ul chloroform, đảo đều, li tâm 13000 vòng/phút, 10 phút, nhiệt độ phòng. Thu dịch nổi vào epp mới. Ước tính thể tích thu được.
  8. Thêm vào epp trên 2,5V ethanol tuyệt đối lạnh, ủ ở -20oC, 30 phút.
  9. Li tâm 13000 vòng/phút, 20 phút, 4oC. Hút bỏ dịch nổi, thu tủa.
  10. Rửa tủa trên với 500 ul ethanol 70% lạnh, li tâm 13000 vòng/phút, 10 phút, 4oC. Hút bỏ dịch nổi, thu tủa. Phơi khô.
  11. Hòa tủa vào 20 ul H2O. Giữ ở -20oC.
 
01 tiểu nhóm nhận 02 ống nghiệm dung dịch nuôi cấy E. coli 03 tiểu nhóm nhận: Một bộ dung dịch, hóa chất tách chiết 
  
 
           
 
Buổi   Nội dung thực tập Chi tiết
3 và 4
Ngày
04/4/2019
Sáng
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Chiều
Bài số 2: Phân tích DNA Giảng bài: phân tích DNA bằng phương pháp đo mật độ quang, điện di gel agarose
 
Bài số 3: Kỹ thuật PCR
  1. Giảng bài Lý thuyết kỹ thuật PCR
  2. Sinh viên thực hành đặt phản ứng PCR.  
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Sinh viên thực hành điện di DNA trên gel agarose
  1. Phân tích DNA bộ gene bằng phương pháp đo mật độ quang
Mỗi nhóm pha loãng 5 lần dung dịch DNA thu được ở bài 1. CBGD sẽ đo mật độ quang. Sau đó, mỗi nhóm nhận và phân tích kết quả đo mật độ quang.
  1. Thực hiện nhân bản gene mục tiêu bằng phương pháp PCR
Mỗi tiểu nhóm tiến hành hút lần lượt các thành phần phản ứng PCR vào epp 0,2 ml sao cho đạt nồng độ sau:
DNA tổng số                               100 ng hoặc DNA plasmid (từ bài 1)
Buffer (10X)                               1X dNTP Mix, 2 mM each             0,2 mM
MgCl2 (25 mM)                         2 mM      
                         Mồi xuôi (2,5 mM)                       0,2 mM
                         Mồi ngược (2,5 mM)                    0,2 mM
                         Taq polymerase (1 u/μl)               0,5 u
                         Bổ sung dH2O đến                        25 ul 
Đặt epp có chứa hỗn hợp phản ứng PCR vào máy PCR. 
Mỗi tiểu nhóm nhận 01 bộ hóa chất cho phản ứng PCR CBGD sẽ bổ sung enzyme cho các nhóm.
3. Phân tích DNA bằng điện di trên gel agarose: Mỗi nhóm tiến hành điện di mẫu DNA bộ gene thu được ở bài 1 và sản phẩm PCR thu được ở bài 3
 
           
 
Buổi Nội dung thực tập Chi tiết
5 và 6
 
Ngày
10/4/2019
Sáng
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Chiều
Bài số 4: Biểu hiện
protein tái tổ hợp Giảng về lý thuyết biểu hiện protein tái tổ hợp
 
 
Bài số 5: Phương pháp thu nhận protein
Giới thiệu một số phương pháp thu nhận protein
 
 
 
 
 
 
 
 








Bài số 6: Phân tích
protein
1. Giảng bài: Phân tích protein bằng điện di
SDS-PAGE
Sinh viên tham quan Phòng thí nghiệm sản xuất protein tái tổ hợp (thuộc Phòng thí nghiệm Nghiên cứu Ung thư), xem các hệ thống sản xuất protein, các thiết bị thu nhận và tinh chế protein.
 
3 nhóm nhận 01 bộ gồm các mẫu sau đây:
  • 500 ul dịch phá tế bào E. coli đã được cảm ứng biểu hiện protein mục tiêu (1)
  • 500 ul dịch tinh chế protein mục tiêu cảm ứng biểu hiện từ E. coli (4)
  • 500 ul dịch lên men Pichia pastoris được cảm ứng biểu hiện protein mục tiêu (5)
  • 500 ul dịch tinh chế protein mục tiêu cảm ứng biểu hiện từ P. pastoris (6)
 
1. Thực hiện thu nhận riêng các phân đoạn protein tổng, tan, tủa từ dịch phá tế bào E. coli:
  • Hút 50 ul dịch (1) sang 1 epp khác để sử dụng cho bài sau.
  • Ly tâm phần còn lại của dịch (1) với tốc độ 13000 vòng/phút trong 3 phút.
  • Hút phần dịch nổi sang 1 epp khác (2)
  • Hòa tan phần tủa bằng 450 ul H2O (3)
 
2. Thực hiện điện di SDS-PAGE
- 3 nhóm điện di 6 mẫu protein gồm các mẫu được ký hiệu (1), (2), (3), (4), (5),
(6) ở trên.
    2. Thực hành điện di
SDS-PAGE
  • Hút 50 µl mẫu protein vào epp mới. Bổ sung 10 µl dung dịch xử lý mẫu 6X (sample buffer 6X). Trộn đều. Đun ở 100ºC trong 15 phút. Ngâm nước đá trong 5 phút.
  • Nạp 10 µl mẫu đã xử lý vào giếng.
  • Điện di với dòng điện có cường độ ổn định 2 mA/giếng, hiệu điện thế 110 V trong 30 phút, sau đó, chỉnh hiệu điện thế 220 V đến khi vạch xanh ra khỏi gel.
  • Chuyển gel vào hộp thuốc nhuộm coomassie brilliant blue. Lắc nhẹ trong 30 phút.
  • Chuyển gel vào hộp chứa dung dịch giải nhuộm. Lắc nhẹ đến khi nền gel hết màu xanh.
03 tiểu nhóm sử dụng chung 1 miếng gel
CBGD chuẩn bị gel SDS-PAGE và gỡ gel sau khi điện di xong.
 
 
           
Buổi   Nội dung thực tập   Chi tiết
7 và 8
 
Ngày
11/4/2019
Sáng
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Chiều
Bài 6: Phân tích protein
(tiếp theo)
  1. Giảng bài: Một số phương pháp định
lượng protein
  1. Thực hành xác định nồng độ protein bằng phương pháp Bradford
  2. Thực hành xác định tỷ lệ % protein mục tiêu
 
 
 
 
 
 
Tiếp tục thực hành các kỹ thuật phân tích protein
1. -
-
- -
 
2.
-
-
-
-
-
-
Xác định nồng độ protein tổng bằng phương pháp Bradford Mỗi 3 nhóm đo nồng độ protein 4 mẫu: (2), (4), (5), (6) ở trên.
Hút 300 µl mẫu vào ống nghiệm. Bổ sung 1200 µl thuốc thử Bradford. Trộn đều. Để yên 10 phút.
Đo mật độ quang ở bước sóng 595 nm.
Dựa trên đường chuẩn và giá trị OD595 đo được, tính toán nồng độ protein trong mẫu. Kết quả được chấp nhận khi giá trị OD595 nằm trong giới hạn tuyến tính của đường chuẩn.
Xác định tỷ lệ % protein mục tiêu bằng phần mềm GelAnalyzer
Gel điện di SDS-PAGE được scan để lưu trữ dưới dạng file ảnh.
Mở phần mềm, chọn New analysis, chọn file ảnh muốn phân tích.
Chọn Add new lane tại mục Lanes mode để chọn giếng điện di cần phân tích. Có thể sử dụng chức năng Modify lanes để chỉnh sửa lại khu vực chọn.
Chuyển qua thẻ Bands mode, chọn Add new band để bắt đầu xác định từng vạch protein. Sau khi đã chọn đủ các vạch protein có trong giếng, chuyển qua bước tiếp theo.
Vào thẻ Background subtract mode, chọn Rolling ball. Lúc này một bảng nhỏ hiện ra, nhập giá trị cho Ball radius. 
Sau khi thực hiện bước Rolling ball, ô Analysis info sẽ hiện ra thông tin về diện tích của các vạch trên giếng. Tỷ lệ của protein mục tiêu trong hỗn hợp là tỷ lệ diện tích của protein mục tiêu trên tổng diện tích.
CBGD scan gel điện di của các nhóm
03 tiểu nhóm chuẩn bị 01 laptop
 
 
 
Bạn đã không sử dụng Site, Bấm vào đây để duy trì trạng thái đăng nhập. Thời gian chờ: 60 giây